Histologie: Techniken und Färbungen

Verwendung 

Gängig ist die Anfertigung von Präparaten für die Lichtmikroskopie, üblicherweise in den Vergrößerungen 10-fach, 20-fach und 40-fach. Bei der 100-fachen Vergrößerung muss zur Betrachtung der Präparate ein Adjuvans verwendet werden.

Neben der Lichtmikroskopie steht die Elektronenmikroskopie zur Verfügung. Diese ist mit einem höheren technischen Aufwand und einer höheren Empfindlichkeit der Präparate verbunden. 

Präparation

Um Gewebeproben für die Lichtmikroskopie aufzubereiten, müssen verschiedene Arbeitsschritte durchlaufen werden. Grundsätzlich sind das die Fixierung, die Einbettung, das Schneiden und die eigentliche Färbung des Präparats. 

Ziel der Fixierung ist der Erhalt von Gewebe und Zellen in möglichst naturgetreuem Zustand. Dazu müssen alle Prozesse, die üblicherweise postmortal oder nach Gewebeentnahme ablaufen, gestoppt werden. Dazu zählen das Anschwellen von Zellen infolge von Wassereinstrom und Schrumpfung von Geweben infolge von Austrocknung.

Die Standardmethode der Wahl ist die chemische Fixierung mithilfe von Formaldehyd. Sofort nach der Gewinnung der Probe wird diese in eine Formaldehydlösung eingelegt. Dabei kommt es zur Vernetzung sowie einer leichten Denaturierung aller Proteine. Lipide und Kohlenhydrate werden davon nicht betroffen. Die Wirkung auf Proteoglykane und Glykoproteine ist begrenzt.

Auf die Fixierung folgt die Einbettung in Paraffin. Dabei wird das Gewebe in flüssiges Paraffin eingetaucht und durchtränkt, anschließend härtet das Paraffin aus. Paraffinblöcke sind extrem hart, dadurch ist es später möglich vom Präparat feine Schnitte anzufertigen.

Voraussetzung für die Einbettung ist das vollständige Entfernen von Wasser, da Paraffin praktisch vollkommen wasserunlöslich ist. Dies wird erreicht, indem das Wasser in einem längeren Prozess schrittweise durch Ethanol ersetzt wird. Ethanol wird wiederum schrittweise durch ein Intermedium wie Xylol ersetzt, und dieses letztlich schrittweise durch flüssiges Paraffin.

Der paraffinierte Gewebeblock wird in das Mikrotom eingespannt, ein Gerät, das mit besonderen Messern zum Schneiden solcher Blöcke ausgestattet ist. Dieses Gerät erlaubt die Einstellung bestimmter Schichtdicken, die sich im ultradünnen Bereich bewegen.

Die gewonnenen Schnitte werden anschließend auf Objektträger aufgebracht. 

Als nächster Schritt muss das verbliebene Paraffin wieder herausgelöst werden, z.B. mit Xylol. Dieser Vorgang wird als Entparaffinieren bezeichnet.

Anschließend erfolgt das Färben des Präparates. Dazu wird der Objektträger für eine vordefinierte Zeit in eine Färbelösung gestellt. Je nach Färbungstyp wird der Objektträger anschließend noch in andere Lösungen eingebracht. Die überschüssige Farbe wird mithilfe spezieller Spüllösungen entfernt.

Auf das Präparat wird abschließend ein Deckglas aufgebracht, das mithilfe eines Klebstoffs fixiert wird (Eindecken).

Das Ergebnis dieser gesamten Vorgänge ist ein Dauerpräparat. Solche Präparate sind extrem langlebig. Präparate in vielen anatomischen Sammlungen sind über 50 Jahre alt. Bei korrekter Durchführung der Arbeitsschritte ist davon auszugehen, dass solche Dauerpräparate weit über hundert Jahre erhalten bleiben werden.

Neben der beschriebenen Vorgehensweise existiert noch eine weitere, deutlich weniger zeitaufwändige Methode zur Anfertigung von Präparaten. Dabei wird das fixierte Material umgehend gefroren.

Der stark heruntergekühlte Eisblock kann unmittelbar in einem Gefriermikrotom geschnitten und die Schnitte können direkt auf einen Objektträger aufgebracht werden. Die Färbung erfolgt sofort. Alle weiteren Schritte entfallen. Diese Vorgehensweise eignet sich bei Zeitmangel oder wenn die Proteindenaturierung noch geringer gehalten werden soll. Solche Präparate stellen in der Regel keine Dauerpräparate dar und haben nur eine geringe Haltbarkeit.

Standardfärbungen

Eine Reihe von Färbungen werden als Standardfärbungen bezeichnet, weil sie breiten Einsatz finden.

Ziel der Standardfärbungen ist es, Gewebe so darzustellen, dass die enthaltenen Strukturen voneinander abgegrenzt werden können. Sie werden daher auch als Übersichtsfärbungen bezeichnet.

Grundlage für solche Färbungen sind die unterschiedlichen Affinitäten der Farbstoffe für bestimmte Gewebebestandteile. Verantwortlich dafür sind elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Farbstoff und Gewebebestandteil.

Zu den wichtigsten Standardfärbungen gehören:

• Eisenhämatoxylin: Zellkerne
• Hämatoxylin-Eosin (HE): Zellkerne und Zytoplasma
• Azan, Masson, Goldner, van Gieson: Kollagenfasern
• Orcein, Resorcin-Fuchsin: elastische Fasern

Spezialfärbungen

Zur Darstellung von Polysacchariden, Glykoproteinen, Muzinen oder Glykolipiden eignet sich die PAS-Färbung. PAS ist die Abkürzung für periodic acid-Schiff, was für Perjodsäure (HIO4) und Schiff-Reagenz (fuchsinschweflige Säure) steht. Typisch hierfür ist die purpurrote Farbe.

Retikuläre Fasern lassen sich mit einer Silberimprägnation, z.B. nach Gomori, anfärben. Dabei reduzieren Silberionen zu metallischem Silber, welches ausfällt und reagierende Strukturen schwarz darstellt.

Zur Darstellung von Fetten eigenen sich besondere Fettfärbungen, z.B. Sudan III oder Sudanschwarz. Der Farbstoff setzt sich in den Lipiden eines Gewebes ab, da er sich in Fett besser löst als im Lösungsmittel des Färbebades. Voraussetzung ist, dass das Präparat vorher nicht mit organischen Lösungsmitteln behandelt wurde.

Äquivalentbild

Gewebepräparate sind nicht mit ihrem Zustand in der lebenden Zelle identisch. Nur im vitalen Organismus befindet sich das Gewebe im natürlichen Zustand.

Die Anfertigung von Präparaten stellt damit immer eine Situation dar, welche künstlich erschaffen wird. Das erlaubt dennoch in hinreichendem Maße die Beurteilung des Zustandes im lebenden Menschen (pathologische Präparate von vitalem Gewebe) oder im Zustand, als der Mensch noch lebte (pathologische oder rechtsmedizinische Präparationen von Verstorbenen).

Die Darstellung der Situation im lebenden Organismus, welche Rückschlüsse auf den Gewebezustand erlauben, wird als Äquivalentbild bezeichnet. Dabei gilt, dass ein Äquivalentbild bei gleicher Methode im Umgang mit einer Probe reproduzierbar sein sollte.

Artefakte

Artefakte sind alle Formen von nicht-reproduzierbaren Veränderungen, die ihre Ursache in der fehlerhaften Präparation einer Probe haben. Sie erlauben somit keinen Rückschluss auf den lebenden Zustand.

Zu den üblichen Artefakten zählen mechanische Schädigungen des Gewebes während der Gewinnung der Probe, autolytische Veränderungen infolge verspäteter Fixierung sowie Schrumpfung oder Quellung durch falsche Verhältnisse der Ionen in einer Fixierlösung. Auch Risse und Falten im Schnitt selbst sowie Niederschläge des Farbstoffs zählen zu Artefakten.

Die folgenden Lerneinheiten werden dir helfen, dein Wissen zu den Grundlagen der Histologie weiter zu festigen. Viel Spaß!